如何進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)？

發(fā)布時間： 2023-08-29　　點擊次數(shù)： 453次

1. 配制培養(yǎng)基: DMEM=內(nèi)酮酸鈉++10%血清++青鏈毒素

2. 復(fù)蘇：37度融化后，擦干凍存管酒精擦，細(xì)胞加入15m離心管，加5ml培養(yǎng)基500g離心5min,棄上清，加1ml 培養(yǎng)基重懸后加入到培養(yǎng)瓶中，5~6ml左右，記得晃勻。

3. 傳代：吸出舊培基，加5mIPBS洗一遍，用移液管加1ml胰酶，洗一遍吸出，37度放1min左右計時看到大片大片脫落了即加入新培基吹打，吹洗充分后，吸1ml加到事先加好10ml 新培育基的新瓶里。

293T細(xì)胞是用5型腺病毒75株系轉(zhuǎn)化，含有Ad5E1區(qū)的人胚腎亞三倍體細(xì)胞系，是一種E1區(qū)缺陷互補(bǔ)細(xì)胞系。293T 細(xì)胞是貼壁依賴型呈上皮樣細(xì)胞，表現(xiàn)出典型的腺病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞的表型細(xì)胞允許Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖

哺乳細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)方式有三種:貼壁培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、無血清懸浮培養(yǎng)這三種方式均可用于293T 細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。293T細(xì)胞在無Ca2+或含Ca2+培養(yǎng)基中可同樣生

長，也可生長在血清濃度降低的培養(yǎng)基中。

單層培養(yǎng)細(xì)胞在 5-10%FBS-DMEM 中能生長很好。一般來講，1:10 傳代后，一周可以長滿嚴(yán)禁過度生長，這點很重要。因為會導(dǎo)致細(xì)胞密度加大和堆積，影響病毒斑的形成和轉(zhuǎn)染，傳代時也不易打散

懸浮的293T細(xì)胞很容易大規(guī)模培養(yǎng)，但不容易長期保持穩(wěn)定。293T 細(xì)胞在傳代120次以后，其表型可能改變，生長狀況不再是單層的了，偶爾會形成局部的細(xì)胞成團(tuán)聚集，應(yīng)立即拋棄，重新引入新傳代的細(xì)胞

293T細(xì)胞培養(yǎng)特性:

1. 細(xì)胞明顯適應(yīng)酸性環(huán)境pH值在6.9~7.1時可順利貼壁生長換液293T時動作要輕。一般用高糖的DMEM培養(yǎng)基

2、傳代: 倒去廢液，PBS 洗一次 (輕)，用0.02%EDTA與0.25%Trypsin 消化，生長良好細(xì)胞培養(yǎng)瓶中輕搖,使之流遍所有細(xì)胞表面,即將其吸除或棄去消化 30s，然后吸去，再讓剩下的EDTA/Trypsin 作用30s鏡下觀察細(xì)胞脫落,就可加DMEM 終止消化,反復(fù)吹打至細(xì)胞全成單個懸浮細(xì)胞即可。12小時-24小時 90%以上細(xì)胞貼壁。293細(xì)胞傳代時機(jī)為達(dá) 80-90%匯合，傳代比例為1:3。

3、293 細(xì)胞在低代時容易貼壁，生長良好，在傳到幾十代以后，易聚集成團(tuán)，且貼壁不牢，用PBS沖洗時即可能脫落，即使消化后也不容易吹打成單細(xì)胞懸液，最好購入時先大量凍存

4、復(fù)蘇：293細(xì)胞的另一生長特性是貼壁所需時間長且貼壁不牢。細(xì)胞冷凍后復(fù)蘇時,都有不同程度的腫脹若以50ml培養(yǎng)瓶待細(xì)胞長滿瓶底的70%~80%時消化凍存,復(fù)蘇時將其全部接種至2個50ml 瓶中時較為合適。剛復(fù)蘇的 293 貼壁很慢，復(fù)蘇接種后24小時內(nèi),應(yīng)盡量減少觀察細(xì)胞次數(shù)或不作觀察,以免因晃動而影響細(xì)胞貼壁。復(fù)蘇后48 小時左右觀察貼壁情況并進(jìn)行更換培養(yǎng)基比較合適,如果用一次性塑料培養(yǎng)瓶可增加細(xì)胞貼壁牢度。換液前宜將培養(yǎng)基預(yù)熱

5轉(zhuǎn)染: 體外應(yīng)用293細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染時，如果是采用磷酸轉(zhuǎn)染，一定要注意 293 細(xì)胞不要全部長滿細(xì)胞培養(yǎng)盤，長滿細(xì)胞時加入磷酸鈣就會使 293 細(xì)胞大片的脫落，最好是當(dāng)293生長到 1/2或2/3 時進(jìn)行磷酸轉(zhuǎn)染，可以避免細(xì)胞的大量脫落